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脂來安對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的體外抗病毒效果評價報告

四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 徐志文教授團隊

評價結(jié)論：本實驗評估了脂來安對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的體外抗病毒效果。實驗通過細胞毒性試驗（CCK8法）和病毒抑制效果測試，評估脂來安在不同濃度下對Vero和Marc-145細胞的影響，并分析其對PEDV和PRRSV的抑制作用。在抗PEDV實驗中，脂來安在稀釋10240倍的濃度下表現(xiàn)出顯著的細胞保護作用，顯著提高了Vero細胞的存活率。同時，qPCR檢測結(jié)果表明，脂來安在上述濃度下能夠顯著降低PEDV的病毒RNA拷貝數(shù)，證明其通過抑制PEDV復(fù)制發(fā)揮抗病毒作用。在抗PRRSV實驗中，脂來安在1280至2560倍的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的直接殺滅作用，能夠有效抑制PRRSV的增殖。然而，在這些濃度下，脂來安無法阻止PRRSV感染Marc-145細胞，表明其對PRRSV的抑制作用有限，主要表現(xiàn)在對病毒增殖的抑制，而非阻斷病毒初始感染。綜上所述，脂來安對PEDV具有較強的抑制作用，特別是在特定濃度下能夠顯著降低病毒載量并提高細胞存活率。而對于PRRSV，脂來安表現(xiàn)出一定的抑制效果，但無法阻止病毒的初步感染，其抗病毒作用主要體現(xiàn)在抑制病毒增殖階段。

關(guān)鍵詞：脂來安，豬流行性腹瀉病毒（PEDV），豬繁殖與呼吸綜合征病毒

（PRRSV），體外抗病毒效果評價

1.實驗材料

1.1實驗細胞、病毒與動物

本實驗使用的所有細胞（Vero、Marc-145）、病毒（PRRSV、PEDV)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物生物技術(shù)中心（ABTC）繁殖保存。

1.2實驗器材與試劑

胎牛血清、細胞培養(yǎng)液（DMEM培養(yǎng)液）、胰蛋白酶、PBS緩沖液由ABTC提供；DMSO購買自SIGA（USA）；實驗所使用的CCK8試劑盒（編號：Beyotime.C0038）購買自碧云天生物技術(shù)有限公司；脂來安由新奧公司提供；細胞完全培養(yǎng)基（生長液）為含1O% FBS的DMEM培養(yǎng)基，細胞維持培養(yǎng)基（維持液為（PRRSV：含F(xiàn)BS2%；PEDV不含F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基。

2試驗方法

2.1細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與單層細胞制備

根據(jù)實驗需要分別復(fù)蘇Vero、Marc-145細胞，使用生長液在細胞培養(yǎng)瓶中分別培養(yǎng)Vero細胞（37℃，5% CO₂），傳代1至2代后用胰酶消化傳代接種至4個96孔板，在37℃，5% CO₂下分別培養(yǎng)24h-36h，直到細胞生長至單層。

2.2半數(shù)細胞毒性濃度和最大無毒濃度的測定

取脂來安原液1mL，加入9mL維持液，稀釋成10^-1的母液，再使用維持液

進行2倍梯度稀釋，共設(shè)置11個濃度梯度。將已長成單層細胞的96孔板棄去上清液，加入樣品溶液，100微升/孔，每個組合每個濃度4孔重復(fù)，設(shè)置4個含有1% DMSO的維持液的孔作為對照組A，設(shè)置4個僅使用維持液培養(yǎng)的細胞對照組B，置于培養(yǎng)箱，37℃，5% CO₂，培養(yǎng)48h。

按照CCK8試劑盒說明進行細胞毒性檢測，計算細胞存活率，并使用GraphPadPrism5計算最大無毒濃度（MNTD）。細胞存活率大于90%時對應(yīng)的濃度為無毒濃度，選擇脂來安的最大無毒濃度（MNTD）進行下一步實驗。

2.3體外抗PEDV實驗

將Vero細胞分別接種至96孔板上，在37℃，5% CO₂下分別培養(yǎng)長至單層。將凍存的PEDV病毒液置于冰上解凍，使用維持液將病毒液稀釋至20O TCID₅₀，同時使用維持液將樣液稀釋至2 MNTD，將稀釋后的病毒液與樣液等體積混合，配成終濃度為1MNTD樣品溶液與1O0 TCID₅₀的病毒液的混合液，渦旋混勻，注明溶液中的病毒類型編號，置于-20℃儲存；使用含2% DMSO的維持液與用維持液稀釋至200 TCID₅₀的病毒液等體積混合，渦旋混勻后注明病毒類型，置于-20℃儲存；使用維持液分別將母液稀釋到MNTD濃度，置于-20℃儲存。所有試劑均限當日使用。

設(shè)置4個梯度實驗組，1個病毒對照組，1個空白對照組，每組設(shè)置6個重復(fù)。將已長成單層細胞的96孔板棄去上清液，分別向4個實驗組加入100微升

(0.1×（1/2）⁹,0.1×（1/2）¹⁰,0.1×（1/2）¹¹,0.1×（1/2）¹²）濃度的樣液，向病毒對照組和空白對照組孔中各加入100微升維持液，在37℃，5% CO₂下孵育2h。取出孵育完畢的96孔板，棄去上清液，取配制好的200 TCID₅₀病毒液與（0.2×（1/2）⁹,0.2×（1/2）¹⁰,0.2×（1/2）,0.2×（1/2）¹²）濃度樣液的等體積混合液加入各實驗組孔，每孔100微升；設(shè)置病毒對照組：取100 TCID50的病毒液，加入病毒對照組孔，每孔100微升；設(shè)置空白對照組：取維持液（含實驗組與病毒組等量接毒胰酶）加入空白對照組孔，每孔100微升37℃，5% CO₂下孵育吸附1h。孵育完成后棄去上清液，分別向?qū)嶒灲M孔中加入100微升對應(yīng)濃度的樣品溶液，向病毒對照組和空白對照組孔中各加入100微升維持液，在37℃，5% CO₂下孵育36-72h。36-72h間定時觀察各組產(chǎn)生CPE情況，當病毒對照組出現(xiàn)明顯細胞病變時停止孵育，收集孔內(nèi)上清，CCK8法測各孔OD₄₅₀nm值，計算各組細胞活性，并用qPCR檢測各組病毒CT值與β-actin CT值，計算相對表達量。

2.4 體外抗PRRSV實驗

  采用三種處理方式進行抗病毒實驗，分別是共處理、預(yù)處理和后處理，具體如圖1所示。以下實驗均在安全濃度以內(nèi)完成。

圖1三種處理方式

共處理是為了測定藥物對病毒的直接殺滅作用，將MARC-145細胞接種于96孔板中，長至80%～90%，棄培養(yǎng)液。用不同稀釋倍數(shù)的脂來安和100 TCID₅₀的PRRSV混合液共同作用于細胞2h，棄上清，PBS洗2次，加入維持液，設(shè)空白對照組和病毒對照組，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)至72h，觀察細胞病變及測定藥物處理組和病毒對照組PRRSV載量的變化。

預(yù)處理是為了測定藥物阻斷病毒感染的作用，將MARC-145細胞接種于96孔板，長至80%～90%，PBS洗2次。用不同稀釋倍數(shù)的脂來安作用于細胞2h，棄上清，PBS洗2次，加入100TCID50的病毒液，37°C孵育2h，棄上清，PBS洗2次，加入維持液，設(shè)空白對照組和病毒對照組，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)至72h，期間觀察細胞病變，最終測定藥物處理組和病毒對照組PRRSV載量的變化。

后處理是為了測定藥物對病毒增殖的抑制作用，將MARC-145細胞接種于96孔板，長至80%～90%，棄培養(yǎng)液并用PBS洗2次。加入100 TCID₅₀的病毒液，37°C孵育2h，棄上清，PBS洗2次，加入不同稀釋倍數(shù)的脂來安處理2-6h，設(shè)空白對照組和病毒對照組，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)至48h，測定脂來安處理組和病毒對照組PRRSV載量的變化。

3 結(jié)果

3.1最大無毒濃度測定

采用倍比稀釋法和CCK8試劑盒測定脂來安對Vero細胞的活性影響以確定最大無毒濃度。結(jié)果如圖2所示，當脂來安的濃度為0.1×（1/2）⁹時，細胞的存活率和對照差異不顯著，但是細胞在這個濃度下的形態(tài)發(fā)生改變。因此脂來安對Vero細胞的安全濃度應(yīng)該小于0.1×（1/2）⁹，對應(yīng)稀釋倍數(shù)為5120倍。

采用倍比稀釋法和CCK8試劑盒測定脂來安對Marc-145細胞的活性影響以確定最大無毒濃度。結(jié)果如圖3所示，當脂來安的稀釋倍數(shù)為1280時，細胞的存活率和對照差異不顯著，但是細胞在這個濃度下的形態(tài)發(fā)生改變。因此脂來安對Marc-145細胞的安全濃度稀釋倍數(shù)應(yīng)該大于1280倍。

圖 2 Vero在不同濃度的樣品下的細胞存活率，???; P<0.001; ??; P< 0.01; ?; P<0.05。

圖 3 Marc-145在不同濃度的樣品下的細胞存活率，???P<0.001; ?? P< 0.01; ?P<0.05。

3.2 體外抗PRRSV結(jié)果

3.2.1 共處理實驗結(jié)果

當脂來安的稀釋倍數(shù)在1280～2560之間時，處理組病毒拷貝數(shù)與病毒對照組差異顯著，表明在這個濃度范圍內(nèi)，病毒顯著受到脂來安的抑制，脂來安對PRRSV有一定的直接殺滅作用，但不能完全殺滅病毒。稀釋倍數(shù)為1280時，病毒載量約為10^3.08copies/μL，稀釋倍數(shù)為2560時，病毒載量為10^4.06copies/μL；病毒對照的載量為10^8.56copies/μL。

圖4.共處理試驗結(jié)果，不同稀釋倍數(shù)的脂來安作用下PRRSV拷貝量的變化，??? P<0.001; ?? P< 0.01。

圖5.共處理效果，A：細胞對照，B：病毒對照， C ：1300倍稀釋脂來安處理，D：1600倍稀釋脂來安處理，E：1800倍脂來安稀釋處理。放大倍數(shù)40′。

3.2.2 預(yù)處理試驗結(jié)果

將不同濃度的脂來安處理Marc-145細胞2h，棄液，加入100倍TCID₅₀的PRRSV病毒液孵育1h后棄液，重新加入維持液培養(yǎng)至72h。

根據(jù)病毒載量的變化，預(yù)處理作用效果與病毒對照差異不顯著。脂來安無法阻斷PRRSV對Marc-145細胞的感染。

圖6.預(yù)處理試驗結(jié)果，不同稀釋倍數(shù)的脂來安作用下PRRSV拷貝量的變化，ns表示差異不顯著。

圖7. 預(yù)處理試驗中細胞病變情況，A：細胞對照，B：病毒對照， C ：1300倍稀釋脂來安處理，D：1600倍稀釋脂來安處理，E：1800倍脂來安稀釋處理。

3.2.3 后處理試驗結(jié)果

后處理試驗發(fā)現(xiàn)，脂來安的稀釋倍數(shù)在1280～2560之間時對PRRSV的增殖有一定的抑制作用。稀釋倍數(shù)為1280時，病毒載量約為10^5.27copies/μL，稀釋倍數(shù)為2560時，病毒載量為10^8.2copies/μL；病毒對照的載量為10^8.94copies/μL。

圖8.后處理試驗結(jié)果，不同稀釋倍數(shù)的脂來安作用下PRRSV拷貝量的變化，?? P<0.01; ?P< 0.05。

圖9.后處理試驗中細胞的病變情況，A：細胞對照，B：病毒對照， C ：1300倍稀釋脂來安處理，D：1600倍稀釋脂來安處理，E：1800倍脂來安稀釋處理。

3.3 體外抗PEDV 結(jié)果

如圖10A所示，在特定濃度范圍內(nèi)，脂來安溶液對PEDV感染的Vero細胞表現(xiàn)出顯著保護作用。其中，0.1×(1/2)¹⁰（稀釋10240倍）和0.1×(1/2)¹¹（稀釋20480倍）濃度組的細胞存活率較病毒對照組顯著提高（p<0.05），且0.1×(1/2)¹⁰（稀釋10240倍）濃度組的保護效果最為顯著。

通過qPCR檢測PEDV病毒載量（圖10B），結(jié)果顯示，脂來安稀釋10240倍、20480倍及40960倍濃度組的病毒RNA拷貝數(shù)均顯著低于病毒對照組（p<0.05），其中稀釋10240倍濃度組的病毒抑制效果最為明顯，與細胞活性實驗結(jié)果一致。

圖10. 脂來安體外抗PEDV結(jié)果。A：各組細胞存活率；B：各組PEDV相對表達量；C：0.1×（1/2）⁹實驗組細胞狀態(tài)；D：0.1×（1/2）¹⁰實驗組細胞狀態(tài)；E：0.1×（1/2）¹¹實驗組細胞狀態(tài)；F：0.1×（1/2）¹²實驗組細胞狀態(tài)；G：病毒對照組細胞狀態(tài)；H：空白對照組細胞狀態(tài)，???P<0.001; ?? P< 0.01; ? P<0.05。

4 結(jié)論

（1）實驗結(jié)果表明，脂來安的稀釋倍數(shù)在1280-2560之間對PRRSV具有直接殺滅作用和抑制病毒增殖的作用，但是脂來安在細胞的安全濃度內(nèi)，無法阻斷PRRSV對細胞的感染。

（2）實驗結(jié)果表面，脂來安在特定濃度范圍內(nèi)可顯著抑制PEDV對Vero細胞的感染，并提高細胞存活率。其中，稀釋20480倍表現(xiàn)出最優(yōu)的保護效果，同時該濃度組的PEDV病毒載量（qPCR檢測）亦顯著降低，表明脂來安可能通過抑制病毒復(fù)制發(fā)揮抗PEDV作用。