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技術資訊
Technical Information“脂來安”對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)的
體內(nèi)抗病毒效果評價報告
四川農(nóng)業(yè)大學 徐志文教授團隊
評價結論：本實驗旨在評估脂來安對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的體內(nèi)抗病毒效果。實驗通過設置多個組別（脂來安組、空白對照組、病毒對照組及油對照組）對24頭仔豬進行攻毒，并根據(jù)不同的治療時機及劑量進行口服給藥。結果表明，脂來安在預防PRRSV感染及減輕病毒負擔方面表現(xiàn)出顯著效果。在臨床癥狀方面，脂來安組的仔豬表現(xiàn)出較輕的發(fā)病癥狀，發(fā)病時間較晚，且癥狀較輕。特別是A2組（高劑量脂來安組），癥狀恢復速度較快，無仔豬死亡。相較之下，病毒對照組（C組）仔豬癥狀嚴重，且死亡率較高。此外，脂來安能夠顯著減少病毒的排毒，A組的排毒高峰值明顯低于C組，并且排毒持續(xù)時間較短。病毒載量檢測結果顯示，脂來安能夠有效抑制PRRSV在仔豬體內(nèi)的復制，特別是在肺臟和肺門淋巴結中，病毒載量明顯低于病毒對照組，而油對照組的效果則較為有限。病理觀察證實，脂來安組仔豬的肺組織損傷輕于病毒對照組，表現(xiàn)出較少的炎性細胞浸潤和肺泡損傷。細胞因子分析結果表明，脂來安對炎癥反應有一定抑制作用，尤其在減少促炎因子（如IL-6、TNF-a、IL-1B）的升高方面具有顯著效果。同時，脂來安在高劑量下能夠增強細胞免疫反應，促進IFN-Y的升高。綜上所述，脂來安對PRRSV感染具有明顯的抗病毒效果，能夠有效減輕臨床癥狀、降低病毒載量并調(diào)節(jié)免疫反應，特別是在高劑量使用時，表現(xiàn)出更好的抗病毒作用和免疫調(diào)節(jié)效果。
關鍵詞：脂來安，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），體內(nèi)抗病毒效果評價
1.脂來安體內(nèi)抗PRRSV效果評價
1.1實驗材料
1.1.1實驗試劑
PrimeScript?RT reagent Kit(Perfect Real Time)、DNA/RNA提取試劑盒、TBGreenRPremix ExTaq?(Tli RNaseH Plus)購于寶生物（大連）工程有限公司。
1.1.2毒株和實驗動物
PRRSV NJ毒株由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術中心提供；24頭仔豬及飼料購自成都旺江農(nóng)牧科技有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1仔豬分組及攻毒給藥
在實驗前對試驗場地進行嚴格的消毒，先用甲醛熏蒸過夜，后用百毒殺噴酒消毒。在購進豬后按照規(guī)?；B(yǎng)殖場的條件進行飼養(yǎng)，防止豬群出現(xiàn)應激和細菌感染，隨時注意的豬的清潔工作，用適合仔豬生長的全價飼料進行飼養(yǎng)。先觀察3天，無異常后再進行攻毒與灌服藥物。24頭斷奶仔豬分為6組，每組4頭，詳細分組信息見1，A1、A2組為脂來安試驗組，B組為空白對照組，C組為病毒對照，D1、D2為油對照組。仔豬分組信息、攻毒和給藥時間如下表：
1.2.2臨床癥狀觀察
每日觀察各組仔豬臨床癥狀并收集鼻拭子檢測PRRSV。同時每日測定體溫及采血。當出現(xiàn)明顯的喘氣癥狀并瀕臨死亡時立即處死并剖解，采集肺臟及肺門淋巴結。連續(xù)觀察14d。
攻毒14d后，剖殺全部豬只。采集肺臟組織及肺門淋巴結凍存并固定于4%多聚甲醛。
1.2.3 RT-qPCR定量檢測組織PRRSV載量
將收集到的肺臟、肺門淋巴結研磨后，使用3.0mLPBS充分混勻，置于離心機1200Or/min，離心3min。取上清液，參考RNAiso說明書，抽提RNA。將得到的RNA進行反轉錄得到cDNA。cDNA通過熒光定量PCR，檢測PRRSV病毒載量，反應體系如表6；反應程序：95℃預變性30s；95℃5s；60℃30s；進行40個循環(huán)。溶解曲線：95℃，65℃以每秒升高0.5℃至95℃。
1.2.4仔豬病理組織學觀察
4%多聚甲醛固定的肺臟及肺門淋巴結，經(jīng)過脫水、透化、包埋、切片、脫蠟、復水、染色、封片等步驟，制作HE染色切片，在顯微鏡下觀察病理變化。
1.2.5 細胞因子測定
在攻毒后第0天以及第3天采集仔豬靜脈血，使用試劑盒檢測仔豬血液中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-Y、TNF-a等細胞因子水平。
1.3實驗結果
1.3.1各組仔豬死亡情況
在攻毒給藥后連續(xù)觀察14d，結果顯示（表3）：A組中，A1組第9天有1頭仔豬死亡，A2組無死亡；B組在觀察期間無仔豬死亡；C組第5、9、10、13天分別死亡1頭，共死亡4頭；D1組在第1、13天各死亡1頭，D2組在第8、13天各死亡1頭，共死亡2頭。此外，A、B、D各組剩余仔豬在第14天全部剖殺，C組無剩余仔豬剖殺。
1.3.2攻毒后各組仔豬臨床癥狀觀察
在攻毒后，各組仔豬均出現(xiàn)了發(fā)熱、噴嚏、呼吸困難、神經(jīng)癥狀和采食量下降等臨床癥狀，但不同組之間的發(fā)病先后、嚴重程度及癥狀表現(xiàn)有所差異（如表4所示）。A組（脂來安實驗組）：發(fā)熱、呼吸道癥狀和采食下降的臨床癥狀明顯，但總體表現(xiàn)較輕，發(fā)病時間較晚，癥狀數(shù)量較少，其中A2較A1恢復更快且無死豬。與C組相比，A組的采食量始終較高，且發(fā)熱癥狀較輕，呼吸道癥狀的發(fā)生頻率較低。B組：在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何臨床癥狀。C組：發(fā)熱、呼吸道癥狀和采食下降癥狀較為嚴重，且發(fā)病時間較早，癥狀數(shù)量較多，頻繁死豬。D組：臨床癥狀逐漸表現(xiàn)，但發(fā)病時間較晚，癥狀的嚴重程度介于A組與C組之間，且D1和D2都出現(xiàn)了2頭死豬。
1.3.3試驗期間仔豬體溫變化情況
攻毒后各組仔豬體溫變化情況如附加表1及圖1所示。病毒對照C組仔豬在攻毒后第2天體溫即升高，達到39.260℃，第3天迅速升高至40.810℃，并一直維持在高熱狀態(tài)（最高達41.183C）。A組（A1與A2）亦于攻毒后第3天體溫顯著上升，A1亞組自38.423C升至40.060°℃，第4-6天持續(xù)升高至峰值41.160°C，第7天開始明顯下降，第8天趨于正常；A2亞組體溫變化與A1類似，第3天升至40.187℃，并在第4-6天波動于40.1～40.5℃之間，第8天后逐步恢復正常。對照B組體溫變化幅度較小，始終維持在38.1～39.3℃之間，未出現(xiàn)明顯高熱反應。D組（D1與D2）則在第3天即出現(xiàn)體溫升高現(xiàn)象，D1最高升至41.120℃，D2亦超過40℃，體溫峰值出現(xiàn)略早于A組，且體溫恢復較慢，至第9-10天基本回歸正常范圍。
圖1 各組體溫變化
1.3.4試驗期間仔豬排毒變化情況
滴鼻攻毒后各組仔豬PRRSV排毒量的變化如附加表2及圖2所示。病毒對照C組于第7日至第12天之間維持較高排毒水平，并在第12天達到峰值（TCID50為5.56），排毒持續(xù)至第14天才逐步下降，至第11天仍保持較強病毒排出，顯示出持續(xù)而明顯的排毒過程。A組（A1與A2）排毒趨勢相對溫和，盡管兩組均在第6天左右達到排毒高峰（A1峰值為4.78，A2峰值為4.03），但整體峰值低于C組，且排毒下降速度較快。從第10天起，A1與A2的TCID50值顯著下降，第13天已接近或低于1.0，第14天時A2已檢測不到病毒，A1亦僅為0.54，提示10天后基本不再排毒。空白對照B組在整個實驗期間未檢測到排毒現(xiàn)象，TCID50始終為0，顯示其未發(fā)生感染。D組（D1與D2）排毒情況與C組較為接近，排毒峰值分別在第8至第9天達到5.18（D1）和4.97（D2），雖略低于C組，但高于A組；排毒持續(xù)時間亦較長，至第14天時仍有一定病毒排出（D1為2.31，D2為2.01）。
圖2 攻毒后各仔豬排毒情況
1.3.5攻毒后肺臟、肺門淋巴結病毒載量
攻毒并給藥后，對瀕死仔豬進行剖檢，采集肺臟與肺門淋巴結樣本，通過熒光定量PCR檢測PRRSV組織載量，結果如附加表3及圖3所示。病毒對照C組病毒載量顯著高于其他各組，其肺臟中PRRSV拷貝數(shù)達31427.1copies/g，肺門淋巴結中更高，達到68776.5copies/g，顯示出病毒在呼吸系統(tǒng)組織中的廣泛復制，病理狀態(tài)較為嚴重。相比之下，A組（A1與A2）組織載量明顯較低。A1組肺臟與肺門淋巴結中病毒載量分別為5145.3和15512.3copies/g，A2組略低，分別為4813.5和14547.3copies/g，兩者差異不顯著，提示脂來安具有良好的病毒抑制作用，且在不同個體間具有較穩(wěn)定的效果?？瞻讓φ誃組未檢測到病毒（0.0copies/g），進一步驗證其未被感染，作為對照組顯示良好的對比基準。D組（D1與D2)病毒載量介于A組與C組之間，肺臟載量分別為6964.5和6612.1copies/g，肺門淋巴結為18363.8和17485.8copies/g，說明其對病毒復制具有一定抑制能力，但效果不及A組明顯。
1.3.6仔豬剖檢及病理觀察
通過剖檢觀察可見（圖4），病毒對照C組仔豬肺部病變最為嚴重（圖4a），表現(xiàn)為廣泛的肺組織充血、出血、水腫及間質(zhì)增寬，同時伴有大量炎性細胞浸潤、肺泡上皮細胞脫落與壞死等典型PRRSV感染特征，提示病毒在體內(nèi)高度復制并引發(fā)顯著組織損傷。A組與D組肺臟亦觀察到一定程度的水腫與間質(zhì)增寬（圖4b、c），局部區(qū)域可見輕度充血和出血，但總體病變明顯輕于C組。B組仔豬肺組織結構完整，無明顯病理改變（圖4d），與其未檢測到病毒排毒和組織病毒載量結果相一致。進一步的組織切片觀察結果（圖5）顯示，C組肺部組織中大量炎性細胞及紅細胞滲出（圖5a、b），反映出劇烈的免疫反應和組織破壞；而A組與D組組織切片結構均較完整（圖5c、d），輕微細胞浸潤或出血灶，B組未發(fā)生病毒感染（圖5e、f）。
圖4 仔豬攻毒后肺臟大體病變
A：充血、出血、水腫、間直增寬；B：輕微的充血和間質(zhì)增寬；C：正常情況
圖5 肺臟病理切片觀察
A、B：大量炎性細胞和紅細胞浸潤，間質(zhì)增厚；C、D：輕微細胞浸潤和間質(zhì)增厚；
E、F：未見明顯異常
1.3.7 細胞因子測定結果
如圖6所示，第0天各實驗組仔豬體內(nèi)多種細胞因子（IL-8、IFN-Y、IL-6、TNF-α、IL-1B、IL-10）均處于正?；A水平。攻毒后第3天，各實驗組（A1、A2、D1、D2）及攻毒對照組C的炎癥因子均出現(xiàn)不同程度的升高。在促炎因子方面，C組表現(xiàn)出最強烈的炎癥反應，IL-8、IL-6、TNF-a與IL-1B水平均顯著升高，尤其IL-6與IL-1β在C組中達到最高值（分別為264.96 pg/mL與439.79pg/mL），說明病毒在未干預條件下誘導了劇烈的炎癥風暴。相比之下，A1與A2組各因子升高幅度明顯小于C組，其中A1組普遍高于A2，提示脂來安在高、低劑量下對炎癥反應具有抑制劑量依賴性。在IFN-Y變化趨勢上，各攻毒組均顯著升高，其中A2上升幅度最大，說明脂來安能增強細胞免疫反應的激活。在IL-10（抗炎因子）方面，攻毒后所有處理組IL-10水平均有提升，其中D組與C組IL-10達到200～300pg/mL水平，顯示炎癥后期機體嘗試自我調(diào)節(jié)反應；但A組的IL-10水平上升幅度明顯較低，脂來安可能對抗炎平衡作用有一定抑制?？瞻讓φ战MB在所有細胞因子中均未見明顯波動，證明試驗的可靠性。
圖6 仔豬在PRRSV攻毒并給藥當天與PRRSV攻毒并給藥后第3天細胞因子水平
