評價結(jié)論：為評估“脂來安”對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的體內(nèi)抗病毒效果，本實驗設(shè)計了仔豬感染PEDV后的抗病毒治療研究，通過體內(nèi)實驗評估脂來安對PEDV的抗病毒效果。實驗分為五組：A1組、A2組、A3組為治療組，分別在攻毒同時、攻毒后第二天、攻毒前兩天進(jìn)行脂來安治療；B組為空白對照組，C組為病毒對照組。在體內(nèi)抗病毒效果評估中，仔豬分別進(jìn)行病毒攻毒、臨床癥狀觀察、病毒排毒、病毒血癥、組織病毒載量和死亡率等指標(biāo)的監(jiān)測。結(jié)果表明，脂來安在PEDV感染后的治療效果顯著，其中提前給藥（A3組）效果最佳，能夠有效減輕仔豬的腹瀉、提高存活率、減少病毒載量，并減輕病理損傷；同時給藥（A1組）和延遲給藥（A2組）也表現(xiàn)出一定的抗病毒作用，但效果相對較弱。尤其是在延遲給藥的情況下，部分炎癥反應(yīng)仍然較強，治療效果較差。對照組（B組）仔豬未出現(xiàn)PEDV癥狀，而病毒對照組（C組）仔豬的癥狀持續(xù)惡化，最終死亡。綜合來看，脂來安在抗PEDV方面表現(xiàn)出了較強的抑制作用，特別是在提前給藥的情況下，能夠有效減輕臨床癥狀、降低病毒載量并改善病理損傷，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：脂來安，豬流行性腹瀉病毒（PEDV），體內(nèi)抗病毒效果評價

1脂來安體內(nèi)抗PEDV效果評價

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑

PrimeScript? RT reagent Kit (Perfect Real Time)、DNA/RNA提取試劑盒、TB Green^? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus）購于寶生物（大連）工程有限公司。

1.1.2毒株和實驗動物

PEDV SC株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心提供；20頭仔豬及飼料購買于成都旺江農(nóng)牧科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1仔豬分組及攻毒給藥

在實驗前對試驗場地進(jìn)行嚴(yán)格地消毒，先用甲醛熏蒸過夜，后用百毒殺噴灑消毒。在購進(jìn)豬后按照規(guī)?；B(yǎng)殖場的條件進(jìn)行飼養(yǎng)，防止豬群出現(xiàn)應(yīng)激和細(xì)菌感染，隨時注意豬的清潔工作，用適合仔豬生長的全價飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。先觀察3天，無異常后再進(jìn)行攻毒與灌服脂來安。20頭斷奶仔豬分為5組，每組4頭，詳細(xì)分組信息見表1。取20只斷奶仔豬，隨機(jī)平均分成5組，A₁、A₂、A₃為治療組，B為空白對照組，C為病毒對照組。仔豬分組信息、攻毒和給藥時間如下表：

1.2.2臨床癥狀觀察

每日觀察各組仔豬臨床癥狀并收集糞便檢測PEDV。當(dāng)出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀并瀕臨死亡時立即處死并剖解，采集小腸。連續(xù)觀察7d。

攻毒7d后，剖殺全部豬只解剖。采集腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)凍存并固定于4%多聚甲醛。

1.2.3 RT-qPCR定量檢測組織PEDV載量

將收集到的腸道組織、腸系膜淋巴結(jié)及糞便，研磨后，使用3.0mL PBS充分混勻，置于離心機(jī)12000r/min，離心3min。取上清液，參考RNAiso說明書，抽提RNA。將得到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。熒光定量引物PEDV F:AAATGGGAAGTCGGCAGA；PEDV R:GTTTTGTTGTGGCGGTAG。cDNA通過熒光定量PCR，檢測PEDV病毒載量，反應(yīng)體系如表2；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s；95℃5s；60℃30s；進(jìn)行40個循環(huán)。溶解曲線：95℃，65℃以每秒升高0.5℃至95℃。

1.2.4 仔豬病理組織學(xué)觀察

4%多聚甲醛固定的腸道組織，經(jīng)過脫水、透化、包埋、切片、脫蠟、復(fù)水、染色、封片等步驟，制作HE染色切片，在顯微鏡下觀察腸道病理變化。

1.2.5 細(xì)胞因子測定

在攻毒后第0天以及第3天采集仔豬靜脈血，使用試劑盒檢測仔豬血液中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子水平。

1.3 實驗結(jié)果

1.3.1 攻毒后各組仔豬死亡情況

  在攻毒和給藥后，連續(xù)觀察7天，結(jié)果顯示（表3）：A組中，A2組在第6天有1頭豬死亡，之后沒有仔豬死亡。B組沒有仔豬死亡。C組在第4天死亡一頭。

1.3.2 攻毒后各組仔豬臨床癥狀觀察

  如表4所示，在攻毒后，A組和C組仔豬均表現(xiàn)出腹瀉、厭食及精神萎靡等臨床癥狀，但隨病程發(fā)展，兩組病情出現(xiàn)明顯差異。A組仔豬腹瀉癥狀逐漸減輕，精神狀態(tài)和采食量穩(wěn)步恢復(fù)，其中A1組和A3組恢復(fù)情況相似，A2組恢復(fù)相對較慢。C組病情持續(xù)惡化。B組仔豬未出現(xiàn)明顯異常，始終保持良好狀態(tài)。

1.3.3 脂來安對仔豬攻毒后排毒的影響

每日采集肛門糞便樣本并測定PEDV CT值。結(jié)果顯示（附加表1和圖1）：A1組和A3組CT值在第1天達(dá)到最低點，隨后持續(xù)上升；A2組在給藥后CT值開始升高，表明脂來安對PEDV增殖具有抑制作用。B組未檢測到PEDV。C組CT值持續(xù)下降，表明病毒載量隨時間不斷上升，在死亡時達(dá)到最高值。

1.3.4 脂來安對仔豬攻毒后各組織病毒載量的影響

剖殺瀕死的仔豬及7天后存活的仔豬，取出腸道組織和腸系膜淋巴結(jié)，通過熒光定量PCR方法檢測組織中的病毒載量。結(jié)果如附加表2和圖2所示：A組的兩個組織中病毒載量均顯著低于C組，且腸系膜淋巴結(jié)和腸道的病毒載量大致相當(dāng)。而在C組中，腸系膜淋巴結(jié)的病毒載量明顯高于腸道組織。結(jié)果表明，脂來安能夠有效降低腸道及腸系膜淋巴結(jié)中的病毒載量。

1.3.5 仔豬剖檢及病理觀察

C組（攻毒對照組）仔豬在接種病毒48小時內(nèi)均出現(xiàn)典型的流行性腹瀉臨床癥狀，包括身體消瘦、精神萎靡、食欲下降、被毛粗亂，并排出黃色水樣糞便，伴有惡臭味（圖3a、b、c）。部分仔豬因嚴(yán)重腹瀉脫水，無法站立。攻毒后第3天開始有仔豬死亡，死亡1頭。剖檢結(jié)果顯示：腸腔內(nèi)充滿黃色內(nèi)容物和氣體，腸壁變薄，呈半透明狀，缺乏彈性，腸系膜淋巴結(jié)明顯腫大，符合PEDV的典型病理變化。其他器官未見明顯異常。7天后，C組無仔豬存活。

A組（脂來安組）的臨床癥狀較C組逐漸減輕。其中，A1組和A3組發(fā)生腹瀉，但無仔豬死亡，剖檢癥狀與C組相似。A2組在第6天有1頭仔豬死亡，其余仔豬均存活至7天。B組未見明顯異常（圖3d）。

病理切片觀察顯示：C組仔豬腸道腸絨毛斷裂或萎縮變短（圖4a），絨毛間隙增大，部分區(qū)域出現(xiàn)破損，上皮細(xì)胞壞死脫落，伴有炎性細(xì)胞浸潤（圖4b、c）。A組腸道腸絨毛有輕微破損，出現(xiàn)融合現(xiàn)象，并伴有炎性細(xì)胞浸潤（圖4d、e）。B組腸道病理切片顯示小腸組織形態(tài)正常，腸絨毛排列整齊，絨毛和杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見（圖4f）。

1.3.6 細(xì)胞因子測定結(jié)果

根據(jù)各組仔豬細(xì)胞因子測定結(jié)果（附加表3和圖5）可見，在病毒對照組（C）中，幾乎所有促炎因子（IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、IL-1β）在3d均大幅上升，表現(xiàn)出典型的炎癥風(fēng)暴特征，同時IL-10也有所上升，提示機(jī)體啟動抗炎調(diào)節(jié)機(jī)制。

在治療組中，A1（同時給藥）和A3（提前給藥）能明顯抑制炎癥因子的過度升高，表現(xiàn)為TNF-α、IL-8等雖有增加，但上升幅度低于病毒對照組，尤其是A3，在炎癥因子整體水平上更接近于可控狀態(tài)，提示其在預(yù)防炎癥反應(yīng)上作用最佳。相比之下，A2（延遲給藥）雖然大部分因子也有一定緩解，但IL-1β卻異常升高，說明在炎癥已被觸發(fā)后再進(jìn)行干預(yù)，藥物效果有限，甚至可能放大炎癥反應(yīng)。

在空白對照組（B） 中，細(xì)胞因子水平保持穩(wěn)定，僅有輕微波動，驗證了基礎(chǔ)水平的可靠性。

總體而言，病毒感染會誘導(dǎo)強烈的促炎因子風(fēng)暴，而藥物干預(yù)能在不同程度上緩解炎癥，結(jié)合臨床癥狀、組織切片和細(xì)胞因子水平分析，預(yù)防性給藥（A3）效果最佳，同時給藥（A1）次之，而延遲給藥（A2）效果不明顯。與此同時，IL-10的普遍升高說明機(jī)體在炎癥過程中始終伴隨負(fù)反饋調(diào)控，力圖維持免疫平衡。